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Was ist eigentlich …?! – Neue ZüchtungsTechniken sachlich und verständlich erklärt

 

Wissenschaftlerkreis Grüne Gentechnik e.V. (WGG), Frankfurt/ Main

 

In den letzten Jahren haben neu entwickelte molekularbiologische Verfahren an Bedeutung gewonnen, die unter dem Begriff Neue Züchtungstechniken zusammengefasst werden.
Die neuen Techniken haben auch für die Pflanzenzüchtung und die Pflanzenbiotechnologie großes Potenzial. Dies beruht unter anderem auf den Möglichkeiten, Mutationen oder Gene gezielt in die Pflanze einzubringen oder bestimmte Gene in ihrer Aktivität zu verändern.

Die Techniken, die im Moment vorrangig besprochen werden:

 

GENOME EDITING

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Genome Editing
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  • CrisprCas
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CrisprCas
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  • Zinkfingernukleasen (ZFN)
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Zinkfingernukleasen
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  • Talen (Transcriptor Activator-Like Effector Nuklease)
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Talen
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Oligo Directed Mutagenesis (ODM)

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Oligo Directes Mutagenesis
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RNA-dirigierte DNA-Methylisierung (RdDM)

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RNA-dirigierte DNA-Methylisierung (RdDM)
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Pfropfung

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Pfropfung
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Agroinfiltration

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Agroinfiltration
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Cisgenese

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Cisgenese
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Im Detail:

 

Genome Editing

12. Februar 2016

Wissenschaftlerkreis Grüne Gentechnik e.V. (WGG), Frankfurt/ Main

 

Was?

Molekularbiologische Methoden, mit denen das Erbgut gezielt umgeschrieben und verändert werden kann.

 

Kurzbeschreibung

Mit dem Verfahren des Genome Editing ist es möglich, punktgenaue Veränderungen (Mutationen) im Erbgut zu erzeugen. Gene können an- oder ausgeschaltet, eingefügt oder entfernt werden. Die Erbinformation wird so präzise bearbeitet, als wäre sie ein Text in einem Schreibprogramm – Buchstabe für Buchstabe. Diese vielfältigen Arten der genetischen Bearbeitung werden als Editing zusammengefasst, als Redigatur. Die Methoden sind sehr effizient und äußerst vielversprechend für die Pflanzenzüchtung.

genome Editing

Technik

Im Kern handelt es sich bei dem Verfahren des Genome Editing um ausgesprochen präzise Schneidewerkzeuge. Ihnen gemeinsam ist ein geniales Prinzip: Sie funktionieren wie ferngesteuerte Scheren fürs Genom. Das älteste dieser Instrumente, die sogenannte Zinkfingernuklease, wurde in den späten 1990er-Jahren entwickelt. Zehn Jahre später kamen die sogenannten TALEN-Gen-Scheren hinzu. An der Spitze der methodischen Evolution steht gegen- wärtig CRISPR/Cas, die jüngste und am einfachsten anzuwendende Methode.

 

Prinzipiell verlaufen die Verfahren in zwei Schritten:
(1) Durch Restriktionsenzyme (Enzyme, die DNA an bestimmten Positionen erkennen und schneiden können) wird die DNA an genau definierten Stellen geschnitten. Durch das gezielte Schneiden der DNA werden hier Brüche in der DNA herbeigeführt.

 

(2) Mit Hilfe natürlicher Reparaturmechanismen wie homologer und nicht-homologer Rekombination können nun gezielte Veränderungen des Erbguts vorgenommen werden. (Homologe Rekombination: der Bruch wird repariert, indem ein Stück im Erbgut zunächst kopiert wird und dann in die Bruchstelle eingesetzt wird. Nicht-homologe Rekombination: die Bruchstellen werden direkt miteinander verknüpft, ohne dass Erbmaterial dazwischen eingesetzt wird). Diese Reparaturmechanismen können für die gezielte Veränderung des Erbguts genutzt werden.

 

Bei dem Verfahren des Genome Editings wird also der natürliche Reparationsmechanismus der homologen Rekombination genutzt, um bestimmte Gene in die Bruchstelle einzusetzen. Aber auch der nicht-homologe Reparaturmechanismus kommt zum Einsatz (auch Nonhomologous end joinung – NHEJ genannt): Hierbei werden die DNA-Enden direkt miteinander verbunden. Da diese End-zu-End-Verknüpfung natürlicherweise fehleranfällig ist, wird dieser Mechanismus benutzt, um kleine Veränderungen (Mutationen) zu erzeugen. Ziel ist dann nicht das Einfügen neuer Gene in die Bruchstelle, sondern eben Mutationen in bereits vor- handenen Genen der Pflanze, so dass diese funktionsunfähig werden.

 

Der Schlüssel zum Erfolg der Genome Editing-Technik ist also die Verbindung von perfekter Orientierung und scharfer Klinge. Alle drei Methoden sind in der Lage, exakt definierte Stellen im Erbgut anzusteuern und die DNA an genau dieser Position vollständig zu durchtrennen. An diesen Positionen können Gene an- oder ausgeschaltet, eingefügt oder entfernt werden.

 

Zinkfingernukleasen, die ältesten Werkzeuge des Genome Editing, verteilen die Arbeit auf zwei Bereiche. Der Zinkfingerteil lässt sich so zusammensetzen, dass er direkt an das gewünschte Gen im Erbgut bindet. Der zweite Bereich, die Nuklease, schneidet dann genau an dieser Stelle.

 

Eine Transcription-Activator Like Effector-Nuclease (TALEN) arbeitet nach dem gleichen Arbeitsteilung-Prinzip. Allerdings ist der Teil, der die Schnittstelle im Erbgut erkennt, leichter nach Wunsch zu gestalten als im Zinkfinger.

 

Am einfachsten, schnellsten und kostengünstigsten lässt sich DNA mit einer Kombination aus Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats -CRISPR und der Schere - Cas9 verändern. Der Unterschied: Das System erkennt mithilfe einer Nukleinsäure, der guide RNA, wo es im Erbgut schneiden soll. Diese guide RNA lässt sich beliebig gestalten.

 

Bei Zinkfinger Nukleasen und TALEN sind es Proteine, die die Sequenz erkennen, an der geschnitten werden soll. Für jede neue Zielsequenz muss ein neues Proteine hergestellt werden. Das ist vergleichsweise komplex. Nukleasen, wie die Guide RNA bei der CRISPR/Cas9- Technologie sind dagegen sehr einfach und kostengünstig zu erzeugen, können allerdings nicht so flexibel wie TALEN jede beliebige Sequenz ansteuern.

 

Bleibt man auf der Zeitachse ihrer Entdeckung - also seit den 1990er Jahren bis heute - und vergleicht den Stand mit dem der im jeweiligen Zeitraum gängigen PC-Technologie, dann kann man sich ein Bild von deren jeweiligen Entwicklungsstand machen: Zinkfingernukleasen stehen für den sperrigen PC, TALEN schon für den Laptop und Crispr/Cas für das federleichte Tablet.

 

Anwendung

Die möglichen Anwendungen sind enorm vielfältig. Durch die Einführung gezielter Mutationen lässt sich die Ausprägung von Genen (Genexpression) oder die Gene selbst durch Veränderung der Gensequenz verändern. Dadurch können Gene ein- oder ausgeschaltet oder die Eigenschaften der aus ihnen resultierenden Proteinen verändert werden. Es lassen sich aber auch DNA-Sequenzen bis zu ganzen Genen einfügen, im Unterschied zur „klassischen“ Gen- technik aber an gezielter Stelle und ohne zusätzliche Fremdsequenzen.

 

Erste neue Sorten, die mit Genome Editing entwickelt wurden, sind bereits auf dem Markt. Da sie erheblich schneller und kostengünstiger sind als gentechnische Verfahren, können es sich auch kleine Unternehmen und Forschungseinrichtungen leisten, Genome Editing in der praktischen Pflanzenforschung einzusetzen. Damit kann es wieder interessant werden, auch eher regionale Kulturarten und Merkmale biotechnologisch zu bearbeiten, nicht nur die großen global angebauten wie Mais, Soja oder Baumwolle.

 

Wissenschaftliche Ansprechpartner
Prof. Dr. Jens Boch, Hannover
boch@genetik.uni-hannover.de

Dr. Frank Hartung, JKI Braunschweig
Frank.hartung@jki.bund.de

 

Weitere Informationen

 

CRISPR/Cas-System

12. Februar 2016

Wissenschaftlerkreis Grüne Gentechnik e.V. (WGG), Frankfurt/ Main

 

Was?

Molekularbiologische Methode, mit der das Erbgut gezielt umgeschrieben und verändert werden kann.

 

Kurzversion

Die Methode ermöglicht es, punktgenaue Veränderungen (Mutationen) im Erbgut zu erzeugen. Gene können an- oder ausgeschaltet, eingefügt oder entfernt werden. Die Erbinformation wird so präzise bearbeitet, als wäre sie ein Text in einem Schreibprogramm – Buchstabe für Buchstabe (Genome Editing). Die Technologie erlaubt es, simpel und mit hoher Präzision, Erbinformation aus dem Genom zu schneiden, neue DNA einzufügen oder die Aktivität gewünschter Gene zu verändern. Ursprünglich ist CRISPR/Cas eine Art Immunsystem, mit dem sich Bakterien gegen für sie schädliche Viren wehren.

 

Technik

Der Name CRISPR/Cas steht für einen bestimmten Abschnitt auf der DNA (CRISPR) und einen begleitenden Eiweißkomplex, der die DNA schneiden kann (Cas).

 

Das CRISPR/Cas-System entstammt einem Mechanismus aus Bakterien, dem CRISPR, das der Virenabwehr dient. Es wird verwendet, um DNA an einer bestimmbaren DNA-Sequenz zu schneiden. Dadurch können z. B. DNA-Sequenzen entfernt oder andere DNA-Sequenzen an dieser Stelle eingefügt werden.

 

Die Bezeichnung CRISPR steht für einen Teil des bakteriellen Immunsystems, das schon 1987 entdeckt, aber in seiner Bedeutung nicht erkannt wurde. Die Funktionsweise der Virenabwehr ist bei Bakterien allerdings ganz anders als beim Menschen. Bei einer Infektion entlässt das Virus ein Teil seiner DNA in die Bakterienzelle. Durch das CRISPR-Cas-System sind die Bakterien in der Lage, die Viren-DNA als fremd zu erkennen und erst nach der Erstinfektion ein gegen das Virus gerichtete Immunsystem aufzubauen. Somit verleiht es Bakterien die Fähigkeit, sich gegen Viren zu wehren, indem sie Teile der Viren-DNA ausschneiden, zerstückeln und als sogenannte Spacer in ihr Genom einbauen. Das Ergebnis ist ähnlich dem Abwehrsystem des Menschen, das durch Infektionen oder Impfungen dazu lernt.

 

Im Detail: Die Bezeichnung CRISPR steht für kurze, gehäufte, regelmäßig unterbrochene palindromische Wiederholungen, was im Englischen clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) heißt. Es handelt sich dabei um sich wiederholende Abfolgen von gleichen DNA-Bausteinen (Repeats), sogenannte Palindrome - Erbgutabschnitte, die sich vorwärts oder rückwärts lesen lassen, so wie „Anna" oder „Otto". Zwischen diesen Strukturen liegen Abschnitte ohne erkennbare Regelmäßigkeit, sogenannte Spacer (Distanzstücke), deren Länge sich zwischen einzelnen Bakterien unterscheiden kann, für einen bestimmten DNA-Strang aber immer dieselbe ist. Es handelt sich dabei um DNA-Sequenzen aus Viren. Das heißt, die Bakterien bauen bei einer Infektion einen Teil des viralen Erbmaterials in ihre eigene DNA ein, genau zwischen zwei Palindrome. Das Bakterium generiert auf diese Weise Cas-Enzyme (Cas steht für CRISPR associated = begleitend/zugehörig und ist ein DNA-schneidendes Enzym, eine Nuklease) zur Zerstückelung der DNA angreifender Viren – vorausgesetzt, es kam mit diesem in der Vergangenheit bereits in Berührung und hat überlebt. Diese Sequenz funktioniert wie ein Steckbrief, der Informationen über einen bereits bekannten Virus beinhaltet, der zerstört werden soll. Die Arbeit der Virenbeseitigung erledigt dann das Cas-Enzym. Es erkennt die Virus-DNA anhand des Steckbriefes und zerschneidet sie.

CRISPR/Cas-System

Es wurde gezeigt, dass das CRISPR/Cas-System umprogrammiert werden kann, um jede beliebige DNA-Sequenz (z.B. auch von Pflanzen) zu schneiden. Die Schnitte durch das Cas-Enzym können entweder genutzt werden um ein Gen funktionsuntüchtig zu machen, oder um an dieser Stelle neue DNA einzufügen. Damit das Enzym weiß, wo genau es die DNA schneiden soll, benötigt es zusätzlich eine kurze Guide-RNA. Das ist ein rund 20 Buchstaben langer RNA-Abschnitt, der nur an der Stelle der Pflanzen-DNA binden kann, die zu seiner Sequenz passt. Die Guide-RNA führt das Enzym Cas9 zu der Stelle an der es schneiden soll. Durch Wahl der entsprechenden Guide-RNA kann man sich gezielt aussuchen, welches Gen verändert werden soll. Die zelleigenen Reparatursysteme fügen nun den durchtrennten DNA-Strang wieder zusammen. Dabei können sie DNA-Bausteine, die an der Schnittstelle zur Verfügung stehen, in den Strang einbauen. Auf diese Weise können einzelne DNA-Bausteine verändert oder kurze DNA-Sequenzen neu eingebaut werden.

 

Mit dem Cas-Protein kann man also sequenzspezifisch DNA schneiden, um an dieser Stelle neue Gene einzufügen, Gene zu entfernen oder auszuschalten. So wie sich Buchstaben in einem langen Text verändern lassen. Mit CRISPR/Cas durchgeführte Veränderungen unterscheiden sich nicht von natürlichen Mutationen oder solchen, die mittels konventioneller Methoden herbeigeführt werden. Sie sind dauerhaft und werden an nachfolgende Generationen der Pflanzen vererbt.

 

Anwendung

Bisher wird CRISPR/Cas vor allem in der Grundlagenforschung angewandt, etwa um bisher wenig verstandene Genfunktionen aufzuklären. Wegen seiner besonderen Vorteile wird erwartet, dass das System in naher Zukunft auch in der praktischen Tier- und Pflanzenzüchtung eingesetzt wird. Marktfähige Produkte gibt es bisher jedoch noch nicht.

 

Weitere Informationen

 

TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)

12. Februar 2016

Wissenschaftlerkreis Grüne Gentechnik e.V. (WGG), Frankfurt/ Main

 

WAS?

Molekularbiologische Methode, mit der das Erbgut gezielt umgeschrieben und verändert werden kann.

 

Kurzversion

Die Methode ermöglicht es, punktgenaue Veränderungen (Mutationen) im Erbgut zu erzeugen. Gene können an- oder ausgeschaltet, eingefügt oder entfernt werden. Die Erbinformation wird so präzise bearbeitet, als wäre sie ein Text in einem Schreibprogramm – Buchstabe für Buchstabe (Genome Editing).

 

TALENs sind neu hergestellte Enzyme, die ein natürlich vorkommendes System nachahmen. Mit ihrer Hilfe werden einzelne Bausteine der DNA wie bei einer natürlichen Mutation verändert. Im Gegensatz zur natürlichen Mutation, die immer zufällig und ungerichtet ist, kann mit Hilfe dieses naturanalogen Verfahrens die Mutation gezielt an bestimmten Stellen der DNA ausgelöst werden. Hier können dann Gene ausgeschaltet, entfernt oder neue Gene eingebaut werden.

 

Technik

TALEs sind Proteine, die in bakteriellen Krankheitserregern von Pflanzen entdeckt wurden, den Xanthomonas-Bakterien. Zur Infektion einer Pflanze bringen diese Bakterien einen Cocktail bakterieller Proteine, sogenannte Effektoren, in die befallenen Pflanzenzellen ein. Ein Teil dieser Effektoren ist in der Lage, die Pflanzenzellen zum Nutzen des Bakteriums umzuprogrammieren. Sie nutzen TALE-Proteine, um in Pflanzen gezielt Gene anzuschalten. Dieses natürlich vorkommende System wurde für biotechnologische Anwendungen in den verschiedensten Lebewesen adaptiert.

TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)

TALENs sind neu konstruierte Enzyme, die aus verschiedenen funktionalen Einheiten zusammengesetzt wurden und an einer definierten Stelle DNA schneiden können. Sie werden auch als Designer-Nukleasen bezeichnet, da sie ganz speziell an eine gewünschte DNA-Zielsequenz angepasst werden können. Sie werden ganz ähnlich wie die Zinkfinger-Nukleasen und CRISPR/Cas zum gezielten Verändern von DNA eingesetzt, indem sie die jeweilige Zielsequenz im Genom erkennen und die DNA dort schneiden. An dieser Stelle können dann Gene ausgeschaltet, entfernt oder neue Gene eingebaut werden.

 

Ä̈hnlich wie die ZFN erfüllen auch TALENs zwei Funktionen: DNA-bindender Bereich und Nuklease. Sie werden so konstruiert, dass sie eine ganz bestimmte Zielsequenz im Erbgut erkennen und dort den DNA-Strang schneiden. Dadurch können gezielt Gene entfernt (Knockout) oder mit Hilfe des zelleigenen Reparatursystems modifiziert werden.


TALEN-Proteine sind von der Natur abgeleitete, DNA schneidende Enzyme (so genannte Restriktionsenzyme). Mit ihrer Hilfe werden einzelne Bausteine der DNA wie bei einer natürlichen Mutation verändert. Im Gegensatz zur natürlichen Mutation oder zu Mutageneseverfahren (wie Strahlung oder chemische Stoffe) kann mit Hilfe dieses naturanalogen Verfah- rens die Mutation gezielt an bestimmten Stellen der DNA ausgelöst werden. Die Pflanzen unterscheiden sich nicht von natürlich entstandenen oder induzierten Mutationen.

 

Die Herstellung von TALENs ist einfach und recht schnell. Es sind die zurzeit genauesten Werkzeuge der drei modernen Techniken zum Genome Editing (ZFN, TALEN, CRISPR/Cas).

 

Weitere Informationen

 

Zinkfingernukleasen (ZFN)

12. Februar 2016

Wissenschaftlerkreis Grüne Gentechnik e.V. (WGG), Frankfurt/ Main

 

Was?

Molekularbiologische Methode, mit der das Erbgut gezielt umgeschrieben und verändert werden kann.

 

Kurzbeschreibung

Die Methode ermöglicht es, punktgenaue Veränderungen (Mutationen) im Erbgut zu erzeugen. Gene können an- oder ausgeschaltet, eingefügt oder entfernt werden. Die Erbinformation wird so präzise bearbeitet, als wäre sie ein Text in einem Schreibprogramm – Buchstabe für Buchstabe (Genome Editing).

 

Zinkfinger-Nukleasen sind nach Vorlage aus der Natur neu zusammengefügte Proteine, die bestimme DNAAbschnitte aufspüren und schneiden können. Gene können ganz gezielt korrigiert, ausgeschaltet oder neu an einen vorbestimmten Ort eingefügt werden.

 

Technik

Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) sind neu zusammengesetzte Proteine, welche die DNA an einer gewünschten Stelle schneiden können, um das Genom hier zu verändern. Sie bestehen aus zwei funktionellen Bereichen: Der Zinkfingeranteil des Proteins bindet sich an das gewünschte Gen im Erbgut der Pflanze an. Man findet viele Zinkfingerproteine natürlicherweise in den Organismen z.B. als Steuerproteine für die Expression. Der Nukleaseanteil ist dafür zuständig, die DNA präzise zu schneiden. Solche Nukleasen findet man ebenfalls in allen Organismen natürlicherweise vorkommend. Die Kombination aus beiden wird auch als Designer- Nuklease oder molekulare Schere bezeichnet.

Zinkfingernukleasen (ZFN)

Die Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) kombinieren zwei Funktionen:

  • Um die richtige Stelle im Erbgut anzuvisieren, sind die Zinkfinger notwendig. Das sind besonders zielsichere Eiweiße, die mit ihren fingerähnlichen Ausstülpungen die DNA an einer bestimmten Stelle „anpacken“ können.
  • An die Zinkfinger gekoppelt sind Genscheren, die sogenannten Nuklease-Enzyme. Werden beide Instrumente kombiniert, erhält man ZFN-Genscheren. Diese arbeiten wie pro- grammierbare Roboter, die selbständig eine fehlerhafte DNA-Position ansteuern und reparieren können.

Es gibt verschiedene Varianten der ZFN-Technik. Daran beteiligt sind immer die zelleigenen DNAReparaturenzyme.

 

Durch Zinkfinger-Nuklease-1 (ZFN-1) wird ein Doppelstangenbruch der DNA erzeugt. Das zelleigene Reparatursystem wird dadurch nicht beeinflusst Beim Reparaturvorgang dieses Bruches entstehen Mutationen. Mitunter werden am Ort des Doppel-strangbruchs auch kurze DNA-Stücke neu eingefügt (Insertion) oder entfernt (Deletion). So können mit der ZFN 1-Technik gezielt ortsspezifisch Punktmutationen erzeugt werden, kurze Genomabschnitte verändert oder ausgeschaltet werden.

 

Zinkfinger-Nuklease-2 (ZFN-2): Es werden zusätzlich kurze DNA-Abschnitte eingeführt, die zu den Schnittstellen im DNA-Strang passen. Sie dienen als „Vorlage“ für das Reparatursystem. Durch natürliche Reparaturmechanismen (homologe Rekombination) wird anhand der eingeführten DNA die Veränderung ins Genom der Zelle eingebracht. Auf diese Weise können Gene ausgeschaltet oder repariert werden.

 

Zinkfinger-Nuklease-3 (ZFN-3): In die Zelle wird mit den ZFN ein langes DNA-Stück eingebracht. Dieses enthält ein fremdes Stück DNA, das von zwei Sequenzen flankiert ist, die mit den beiden DNA-Enden am Doppelstrangbruch identisch sind. Durch natürliche Reparaturmechanismen (homologe Rekombination) wird anhand der eingeführten DNA die Veränderung ins Genom der Zelle eingebracht. Auf diese Weise können Gene ausgeschaltet oder repariert werden.

 

Die verschiedenen ZFN-Techniken dienen der GenInaktivierung, der Einführung von bestimmten Mutationen oder dem Einbau von neuen Genen bis hin zur Erzeugung definierter großer Deletionen (Verlust eines Teils der DNA-Sequenz). Der Einbau von fremder oder eigener DNA ins Genom kann gezielt und ohne negative Auswirkung auf vorhandene Gene erfolgen.

Mit ZFN-1/ZFN-2 gezüchtete Pflanze sind nicht von anderen natürlichen oder herkömmlich gezüchteten Pflanzen unterscheidbar. Ein verfahrensspezifischer Nachweis ist daher nicht möglich. Werden mit Hilfe der ZFN-3-Technik neue Gene eingeführt, sind diese Pflanzen von anderen unterscheidbar.

 

Weitere Informationen:

 

Oligonukleotid gesteuerte Mutagenese (ODM)

12. Februar 2016

Wissenschaftlerkreis Grüne Gentechnik e.V. (WGG), Frankfurt/ Main

 

Was?

Verfahren in der Pflanzenzüchtung, bei dem eine punktgenaue Veränderung im Erbgut einer Pflanze herbeigeführt werden kann.

 

Kurzversion

Die Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese (ODM) wird genutzt, um im Erbgut einer Pflanze durch punktuelles Auslösen von Mutationen gezielte Veränderungen durchzuführen. Je nachdem, wo die Veränderungen durchgeführt werden, lassen sich Gene ausschalten oder aktivieren oder die Eigenschaften von Proteinen/Enzymen verändern.

 

Der Vorteil dieses naturanalogen Verfahrens: Im Gegensatz zu natürlichen Mutationen oder Mutageneseverfahren durch Strahlung oder chemische Stoffe kann mit Hilfe der ODM die Mutation ganz gezielt an bestimmten Stellen der DNA ausgelöst werden. Im Pflanzenmaterial kann im Nachhinein nicht festgestellt werden, mit welchem Verfahren die Mutation in das Genom eingebracht wurde.

 

Technik

Bei der ODM werden kurze, im Labor hergestellte DNA-Moleküle, die Oligonukleotide, mit einer Länge von ca. 20 bis 100 Nukleotiden in die Zelle eingebracht, um an einer bestimmten Sequenz ortsspezifisch Mutationen zu erzeugen. Das heißt, das Erbmaterial wird gezielt durch sogenannte Punktmutationen* verändert.

 

Sie sind so hergestellt, dass sie zu ganz bestimmten Genen in der Pflanze passen. Das heißt, sie haben die komplementäre Sequenz einer bestimmten Stelle des Genoms der zu verändernden Pflanze, an der sie andocken können (deshalb „side-specific“ beziehungsweise „gezielt“).

 

Außerdem wird bewusst ein „Fehler“ in die Sequenz eingebaut. Dieser Fehler - nicht die künstliche DNA - wird von der Pflanze in das eigene Gen übernommen.

 

Die Mutationen können Austausche von einzelnen oder wenigen Nukleotidpaaren (NP), kurze Deletionen oder auch kurze Insertionen zelleigener DNA sein. Die Technik beruht auf der sequenzspezifischen Wechselwirkung des Oligonukleotides mit seiner Zielsequenz im Genom der Zelle (gene targeting). Die Oligonukleotide, die in die Zellen eingebracht werden, sind keine neuen Kombinationen genetischen Materials, denn ihre Sequenz richtet sich nach der Zielsequenz.

Oligonukleotid gesteuerte Mutagenese (ODM)

Die Technik imitiert also die Evolution: Sie löst Mutationen aus, die in der Natur in jedem Organismus zufällig auftreten - und die seit Jahrzehnten auch von Pflanzenzüchtern herbeigeführt werden. Bislang wurden zu deren Herbeiführung aber Chemikalien oder Strahlung genutzt. Im Gegensatz zu diesen Vorgängen kann mit Hilfe der ODM die Mutation gezielt an bestimmten Stellen der DNA ausgelöst werden. Im Pflanzenmaterial kann im Nachhinein nicht festgestellt werden, mit welcher Methode die Mutation in das Genom eingebracht wurde.

 

Bei ODM werden die hergestellten Moleküle nur vorübergehend in die Pflanzenzelle eingefügt. Sie vermitteln eine Änderung des Erbguts, ohne dass sie selbst in das Genom der Pflanze integriert werden. Das heißt, sie werden wieder abgebaut.

 

Die Oligonukleotide wirken wie Mutagene und rufen Mutationen von einem oder wenigen NP hervor, wie sie gleichermaßen auch spontan oder nach Anwendung von Mutagenen auftreten können und sind damit nicht von spontanen Mutationen oder von Mutationen, die durch Mutagenese hervorgerufen werden, unterscheidbar.

 

Anwendung

Die Mutagenese mit Oligonukleotiden wurde bereits bei verschiedenen landwirtschaftlichen Nutzpflanzen wie Raps, Mais, Tabak, Reis und Weizen erfolgreich durchgeführt. Das Rapid Trait Development System (RTDS) mit dem das kalifornischen Unternehmen Cibus einen herbizidtoleranten Raps entwickelte, ist eine Variante der Oligonukleotid-gesteuerten Mutagenese. In den USA ist im Frühjahr 2015 der erste Raps ausgesät worden, der mit einer der neuen Methoden entwickelt wurde.

 

*Das heißt: Das Erbgut in der Zelle besteht aus einer Reihe von Nukleotiden, deren Abfolge von der Zelle abgelesen wird, um zum Beispiel Proteine zu bauen. Im inaktiven Zustand liegen zwei komplementäre Stränge wie die beiden Holme einer Leiter nebeneinander. Durch Umwelteinflüsse oder Fehl- funktionen können Mutationen, also Änderungen der Abfolge, entstehen; ist nur ein einziges Nukleotid betroffen wird von einer Punktmutation gesprochen.

 

Wissenschaftlicher Ansprechpartner
Prof. Dr. Klaus-Dieter Jany, Wissenschaftlerkreis Grüne Gentechnik e.V., Frankfurt/Main
jany@wgg-ev.de

 

Weitere Informationen

 

RNA-dirigierte DNA-Methylierung (RdDM)

12. Februar 2016

Wissenschaftlerkreis Grüne Gentechnik e.V. (WGG), Frankfurt/ Main

 

Was?

Pflanzenzüchtungsverfahren, bei dem Gene zeitbegrenzt in ihrer Aktivität unterdrückt werden.

 

KURZBESCHREIBUNG

Ein Pflanzenzüchtungsverfahren, bei dem auch natürlich vorkommende, epigenetische Veränderungen (Epigenetik = Eigenschaften der Zelle, die auf Tochterzellen vererbt werden, die aber nicht in der DNA-Sequenz kodiert sind) an der DNA ausgelöst werden. Bestimmte Gene werden über einige Generationen hinweg in ihrer Aktivität unterdrückt. Die DNA-Sequenz bleibt unverändert.

 

Technik

RNA-dirigierte DNA-Methylierung (RdDM) ahmt natürlich vorkommende, epigenetische Ver- änderungen der DNA nach, sogenannte Methylierungen. Zur Einleitung des RdDM ist die Präsenz von doppelsträngiger RNA (dsRNA) im Zellkern erforderlich. Die de novo DNA Methylierung (die eine "Aussage" zur Aktivität der betroffenen DNA-Sequenz enthält) erfolgt dann und umfasst genau all jene genomischen Sequenzbereiche, die zu der dsRNA Sequenzhomolog (mit ihr übereinstimmend) sind. Sind Promotor-Elemente von der Methylierung betroffen, so führt dies in der Regel zur sogenannten transkriptionellen Inaktivierung des entsprechenden Gens und damit zur Unterdrückung des Gens.

 

Mit Hilfe eines RNAi Konstrukts (imitiert den natürlichen Auslöser der RdDM) kann dieser Mechanismus ausgelöst werden, in Folge dessen Methylgruppen sequenzspezifisch in die DNA eingebaut werden und damit Genaktivität unterdrückt wird. Diese Methylierung kann an einem Gen-Promotor erfolgen und dadurch ein Gen „abschalten“. In der nächsten Generation können dann Nachkommen ausgesucht werden, bei denen das Transgen ausgekreuzt wurde. In den transgenfreien Pflanzen bleibt die Methylierung des Promotors erhalten, womit seine anhaltende Inaktivierung gewährleistet ist und damit auch die neue Eigenschaft erhalten bleibt.

 

Dieser naturanaloge Prozess ahmt natürlich vorkommende epigenetische Veränderungen (Methylierung von DNA) nach. Die DNA-Sequenz (Basenabfolge) selbst wird dabei nicht ver- ändert. Die Methylgruppen führen dazu, dass die entsprechenden Gene für einige Generationen an- oder abgeschaltet werden.

 

Das RNAi Konstrukt ist nur vorübergehend in den Pflanzen vorhanden. Im Endprodukt (der Pflanze, die letztlich vermarktet werden soll) findet man es nicht mehr. Entsprechende Methylgruppen unterscheiden sich bei diesem naturanalogen Verfahren nicht von natürlich vorkommenden Methylgruppen.

 

Anwendung

Mit der RdDM lässt sich die Genexpression ändern, ohne dass im Produkt fremde DNA enthalten ist und keine Veränderungen oder Mutationen in der Gensequenz verursacht werden. Die häufigste Anwendung ist das Abschalten von Genen, beispielsweise um die Produktion eines unerwünschten Proteins zu verhindern.

Da es mit Hilfe gentechnischer Methoden möglich ist, den pflanzeneigenen Mechanismus der DNA-Methylierung auszulösen und zu lenken, kann der oben beschriebene RdDM- Prozess zur Züchtung neuer, epigenetisch modifizierter Sorten ausgenutzt werden.

Die Technik wird in der Forschung angewendet.

Wissenschaftliche Ansprechpartnerin
Prof. Dr. Gabriele Krczal, RLP AgroScience GmbH, Neustadt
gabi.krczal@agroscience.rlp.de

 

Pfropftechnik

12. Februar 2016

Wissenschaftlerkreis Grüne Gentechnik e.V. (WGG), Frankfurt/ Main

 

Was?

Technik zum Zusammenfügen von Pflanzen mit jeweils vorteilhaften Eigenschaften (Veredlung).

 

Kurzbeschreibung

Pfropfen ist eine Technik der Pflanzenveredlung, bei der ein Teilstück einer langsam wachsenden, aber beispielsweise gut fruchtenden Pflanze auf eine andere, wüchsige Pflanze gesetzt wird, wobei beide Teile miteinander verwachsen. So können unterschiedliche Eigenschaften von zwei Pflanzen miteinander kombiniert werden. Die Pfropftechnik kann mit der Gentechnik kombiniert werden und erlaubt so die Vereinigung vorteilhafter Eigenschaften, die mit konventioneller Züchtung schwierig oder nicht erreichbar wären.

 

Technik

Das Pfropfen ist grundsätzlich eine alte Methode. Sie ist sehr verbreitet und wird vor allem bei Zier- und Obstbäumen, bei Weinreben und Kakteen, aber auch bei einigen Blumen und Gemüsearten zur Kombination von Eigenschaften verschiedener Pflanzen eingesetzt.

 

Pfropfen wird als eine Technik der Pflanzenveredlung bezeichnet, bei der ein Teilstück einer Pflanze mit einer anderen Pflanze zusammengefügt wird. Beide Teilstücke verwachsen nach eini- ger Zeit miteinander. Dabei wird ein Spross oder Zweig (der sogenannte „Edelreiser“) einer Pflanze gewonnen und auf einen Wurzelstock (der „Unterlage“) einer anderen Pflanze gesetzt. Der Unterlage werden Äste abgeschnitten oder Kerben in die Rinde geschlagen, um an diesen Stellen den Edelreis einzusetzen. Der Edelreiser wird dabei über die Wurzeln der Unterlage mit Nährstoffen und Wasser versorgt. Dabei wird zum Beispiel ein winterfester Wurzelstock mit einem Haupttrieb kombiniert, der bessere Früchte liefert, aber an der Wurzel gegen Frost empfindlich ist.

 

Das Pfropfen erlaubt die Kombination vorteilhafter Wurzeleigenschaften, die beispielsweise mit Gentechnik in eine Sorte eingeführt wurden, mit bereits vorhandenen vorteilhaften Sprosseigenschaften einer konventionellen Sorte, ohne dass die Früchte des Edelreisers fremde DNA enthalten, also gentechnisch verändert sind. Veränderte Wurzeleigenschaften sind mit konventioneller Züchtung oft schwierig oder praktisch nicht erreichbar. Zudem müssen die Eigenschaften von Wurzel und Spross nicht mit langwieriger Züchtung in einer Sorte vereint werden.

 

Bei Kombination der Pfropftechnik mit der Gentechnik wird dazu am häufigsten das Edelreis einer konventionellen Sorte auf einen gentechnisch veränderten Wurzelstock gesetzt. Grundsätzlich kann aber auch ein gentechnisch verändertes Edelreis auf einen konventionellen Wurzelstock gepfropft werden oder sowohl Edelreis als auch Wurzelstock sind gentechnisch verändert.

Pfropftechnik

Man unterscheidet zwei Ansätze:
(1) Ein Wurzelstock wird mit gentechnischen Methoden verändert, um ihn mit besseren Ei- genschaften auszustatten (z.B. Krankheitsresistenz, verbesserte Bewurzelung, Frosthärte). Auf diesen Wurzelstock wird ein konventionelles Edelreis gepfropft.

 

(2) Ein Wurzelstock wird so verändert, dass in ihm Proteine oder RNA gebildet werden, die über die Leitungsbahnen in das Edelreis transportiert werden und diesen gezielt beeinflus- sen. Die RNA-Interferenz (oder kurz RNAi) ist ein natürlicher Mechanismus der Genregulati- on, der zum Abschalten von Genen in Zellen führt. Hierfür wird ein ein konventionelles Edel- reis auf einen entsprechend gentechnisch veränderten Wurzelstock gepfropft.

 

Fusionierte Pflanzen, die aus einem gentechnisch veränderten Wurzelstock und einem kon- ventionellen Edelreis bestehen, werden auch als „Chimären“ bezeichnet, die als gentech- nisch veränderte Organismen eingestuft werden. Allerdings wurde das Edelreis nicht gen- technisch verändert, so dass auch sowohl dessen Produkte (Samen, Früchte) als auch mög- licherweise resultierender Nachkommen nicht gentechnisch verändert.

 

Anwendung

Gentechnisch veränderte Wurzelstöcke, die dem Ansatz (1) zuzuordnen sind und über eine erhöhte Krankheitsresistenz, Bewurzelungsfähigkeit oder Austrocknungstoleranz verfügen, wurden bereits bei verschiedenen Baumarten, wie z.B. beim Apfel, Birne, Orange und Wein- rebe, aber auch in krautigen Pflanzen, z.B. Gurken, Melonen, entwickelt. Resultierende Chi- mären mit nicht-gentechnisch veränderten Edelreisern werden bereits im Freiland getestet. Züchtungen, die dem Ansatz (2) folgen, befinden sich derzeit noch in der Entwicklung und werden an Modellpflanzen im Gewächshaus getestet.

 

Wissenschaftlicher Ansprechpartner
PD Dr. Matthias Fladung, Thünen Institut für Forstgenetik, Großhansdorf
matthias.fladung@ti.bund.de

 

Weitere Informationen

 

Agro-Infiltration

12. Februar 2016

Wissenschaftlerkreis Grüne Gentechnik e.V. (WGG), Frankfurt/ Main

 

Was?

Agrobakterien werden genutzt, um in Pflanzen eine vorübergehende Expression (Ausprägung/Aktivierung) von Genen herbeizuführen.

 

Kurzversion

Bei der Agro-Infiltration handelt es sich um ein Verfahren, bei dem Agrobakterien (Bodenbakterien, die von Natur aus die Fähigkeit besitzen, Teile ihres Erbmaterials auf Pflanzenzellen zu übertragen) genutzt werden, um in Pflanzen eine vorübergehende, also nicht dauerhafte, Expression von Genen zu erreichen.

Diese Methode wird zum Beispiel in der Pflanzenzüchtung verwendet, um die Auswahl brauchbarer Pflanzen im Verlauf neuer Züchtungsprogramme zu beschleunigen.

 

Technik

Das Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens hat die Eigenschaft, dank natürlicher molekularer Mechanismen DNA in Pflanzenzellen übertragen zu können. Dabei überträgt es aber nur einen sehr kleinen Teil seiner DNA in die Zelle. Diese Fähigkeit des natürlichen Gentransfers wird bei der Agro-Infiltration genutzt, um ein oder mehrere Gene anderer Organismen in Pflanzenzellen einzuführen. Hierzu wird zunächst das Gen eines anderen Organismus in das Agrobakterium übertragen. Nach Übertragung des so genetisch veränderten Bakteriums in das Pflanzengewebe steuert das Gen, sobald von der Pflanzenzelle aufgenommen, die Bildung eines gewünschten Proteins.

 

Im Unterschied zu einer stabilen Transformation, bei der alle Pflanzenzellen das Transgen tragen, werden bei der Agroinfiltration nur wenige Gewebebereiche einer Pflanze, z.B. am Blatt, genetisch verändert. Hierzu wird das Gewebe mit einer flüssigen Agrobakterienkultur infiltriert. Die Ausprägung des hierbei zu übertragenden Gens ist somit nur auf das infizierte Gewebe begrenzt. Über diesen Weg können nicht nur neue Gene übertragen, sondern auch pflanzeneigene Gene ausgeschaltet werden (z.B. durch RNAi-Technologie).

 

Das Ziel bei der Agroninfiltration ist hierbei nur eine kurzfristige Übertragung fremder Gene in einzelne Gewebebereiche mit dem Ziel, die Wirkweise dieser Gene in Pflanzenzellen zu testen. Es werden keine gentechnisch veränderten Pflanzen erzeugt, die die neue Eigenschaft vererben können, da ihre Fortpflanzungsorgane nicht von der Genübertragung betroffen sind.

 

Anwendung

Die Vorteile der Methode liegen in ihrer Geschwindigkeit, Einfachheit und der meist deutlich zu erkennenden und messbaren Genexpression. Auch lassen sich zum Beispiel sehr schnell große Mengen eines gewünschten Proteins in der Pflanze erzeugen und isolieren, was eine Untersuchung des Proteins vereinfacht.

 

In der Forschung wird dieses Verfahren zudem dazu genutzt, um die Wirkungsweise bestimmter Gene in Pflanzen zu testen oder Interaktionen zwischen Pflanzen und Krankheitserregern zu untersuchen.

 

Die Agroinfiltration wird auch als Werkzeug in der Pflanzenzüchtung eingesetzt, um zum Beispiel einzelne Pflanzen darauf zu testen, ob sie gegen eine Krankheit oder Schaderreger resistent sind. Dadurch lassen sich Pflanzen identifizieren, die die gewünschte Resistenzreaktion zeigen.

 

Wissenschaftliche Ansprechpartner

Dr. Jan-Wolfhard Kellmann
LOEWE-Zentrum für Synthetische Mikrobiologie, Marburg
jan-wolfhard.kellmann@synmikro.uni-marburg.de

Dr. Wiebke Rathje, Carl von Ossiezky-Universität, Oldenburg
wiebke.rathje@uni-oldenburg.de

 

Weitere Informationen

 

Cisgenetik

12. Februar 2016

Wissenschaftlerkreis Grüne Gentechnik e.V. (WGG), Frankfurt/ Main

 

Was?

Züchtungsmethode, bei der die Übertragung von Genen lediglich zwischen gleichen oder verwandten und miteinander kreuzbaren Arten stattfindet.

 

Kurzbeschreibung

Bei der Cisgenetik handelt es sich um eine Methode der Pflanzenzüchtung, bei der die genetische Veränderung einer Empfängerpflanze mit einem oder mehreren Genen aus der gleichen oder einer mit der Empfängerpflanze verwandten und kreuzbaren Pflanze vorgenommen wird. Mit anderen Worten: Gene, die über die Technik der Cisgenetik in ein Empfängererbgut eingefügt werden, können auch über natürliche Kreuzungsvorgänge übertragen werden.

Cisgenetik

 

Technik

Das Verfahren der Cisgenetik beschreibt die genetische Veränderung einer Empfängerpflanze mit einem oder mehreren Genen aus der gleichen oder einer mit der Empfängerpflanze kreuzbaren Pflanze. Somit können die Gene, die mittels der Cisgenetik in das Erbgut einer Empfängerpflanze eingefügt werden, auch über natürliche Kreuzungsvorgänge übertragen werden.

 

Im Gegensatz dazu tragen sogenannte „transgene“ (lateinisch: trans = jenseits) Pflanzen ein oder mehrere artfremde Gene im Erbgut, die auch aus Bakterien, Viren oder Insekten stammen können. Mit natürlichen Kreuzungsvorgängen könnten die Gene nicht in die Pflanze eingebracht werden, da unterschiedliche Arten nicht miteinander kreuzbar sind. Die CisgenTechnik verwendet nur Gene aus Arten, die in das Erbgut einer kreuzungsfähigen Art eingefügt werden. Die daraus resultierenden Pflanzen werden auch als „cisgene“ (lateinisch: cis = diesseits) Organismen bezeichnet.

 

Die in cisgenen Pflanzen neu erhaltenen Eigenschaften lassen sich theoretisch auch durch Kreuzungen. Dabei werden jedoch auch zahlreiche Gene übertragen, die sich negativ beispielsweise auf Qualitäts- oder Anbaueigenschaften einer Sorte auswirken und durch aufwändige Rückkreuzungsschritte wieder entfernt werden müssen. Die klassische Züchtungsmethode nimmt also sehr viel mehr Zeit in Anspruch.

 

Auch in cisgenen Pflanzen werden neue Gene mittels gentechnischer Methoden eingeführt, aber anders als bei transgenen Pflanzen stammen diese Gene (und weitere Elemente des eingeführten Genkonstrukts, wie z.B. Markersequenzen) ausschließlich aus dem Genpool der jeweiligen Pflanzenart.

 

Anwendung

Die Cisgenetik ermöglicht viele Anwendungen; dank neu entwickelter anderer Methoden lassen sich Gene zudem punktgenau in das Erbgut einer Pflanze einbauen. Sie eignet sich für die Verbesserung von Kulturpflanzen durch das Einfügen von Resistenzgenen gegen Pilze oder andere Krankheitserreger, die meist aus verwandten Wildpflanzen entnommen werden.

 

Ein Beispiel für Cisgenetik sind die im Projekt „Schorfresistente Äpfel“ erzeugten Linien der Apfelsorte Gala. Diese sind resistent gegen den Apfelschorf dank der Übertragung des Resistenzgens aus einem Wildapfel. Dabei sind alle relevanten Sorteneigenschaften des Speiseapfels erhalten geblieben. Ein anderes Beispiel stellen cisgene Kartoffeln dar, die Resistenzgene aus Wildkartoffeln tragen und damit resistent gegen die gefürchtete Kraut- und Knollenfäule sind. Diese neue Art der Züchtung wird heute aber auch bereits bei Getreide und Zierpflanzen angewendet. Kommerziell erhältlich sind solche Pflanzen noch nicht.

 

Wissenschaftliche Ansprechpartner
PD Dr. Matthias Fladung, Thünen Institut für Forstgenetik, Großhansdorf
matthias.fladung@ti.bund.de

Prof. Dr. Christian Jung, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
c.jung@plantbreeding.uni-kiel.de

 

Weitere Informationen